Praktijk / Practical

verzamelen en bewaren

Voor het verzamelen van mijnen in het veld is niet veel meer nodig dan een goede loupe en een flink aantal plastic zakjes. Neem eventueel een bloem of ander herkenningsmiddel mee om thuis nog te weten van welke plantensoort de bladeren afkomstig was. De handigste zakjes zijn zelfsluitend door middel van een plastic ribbel-en-groef aan de bovenzijde, van10 tot 15 cm hoog. (Officieel heten ze minigripzakjes.) Het is belangrijk dat zakjes met bladeren erin goed gesloten blijven, en dat maar één plantensoort (of 'mijnensoort') in een zakje wordt bewaard; sommige larven kruipen vrij snel uit de mijn, en verpoppen zich soms al in het verzamelzakje. 'Minigripzakjes' blijven door de stijve ribbel vlak, wat handig is omdat de bladeren niet verfomfaaid worden. Maar vooral blijft daardoor weinig lucht in het gesloten zakje, waardoor er weinig gelegenheid tot uitdrogen is. Goed gesloten zakjes kunnen enkele dagen bewaard worden, bij voorkeur maar niet noodzakelijk, in een koelkast.

Na determineren kunnen de bladeren bewaard worden door er herbarium-materiaal van te maken in een plantenpers. Die is gemakkelijk zelf te maken van twee plankjes, ter grootte van een dubbelgeslagen krant (ca. 30 x 45 cm) en twee spanbanden, die bij een sportzaak te koop zijn. Het is belangrijk de bladeren lang (minimaal twee weken) en tussen ruim kranten te drogen, zodat er geen kans op beschimmeling bestaat. Ook moeten de spanbanden stevig worden aangesjord, zodat de bladeren niet bobbelig kunnen opdrogen: drogen in een telefoonboek is niet voldoende! Gedroogde bladeren kunnen worden bewaard in enveloppen. Zelf bewaar ik ze in plastic zakjes (van hetzelfde type en maat als de verzamelzakjes) in kaartsysteemdozen.

collecting and storing

For collecting in the field little more is needed than a really good magnifying lens and a fair number of small plasic bags. It is a good idea to include a flower or another characteristic plant part along with the mine, to remember at home the plant species the mine was taken from. The most convenient bags are self-closing by a sort of tongue-and-groove system at the top, of 10 x 15 cm (they are officially called minigrip bags in Dutch shops). It is important that the bags are completely closed, and that no more than one species (of plant and miner) is put in one bag: some larvae leave the mine surprisingly quickly, sometimes already pupating in the bag. Because of their stiff closing system 'minigrip bags' remain flat. This is an advantage because the leaves are not folded, but especially because the little air in the bag prevents desiccatiion. Well closed bags can be kept safely for several days, preferably, but not necesssarily, in a refrigerator.

After identification the plant material may be dried as herbarium specimens in a plant press - easily made from two boards of about the size of half a newspaper, and two tightening bands, avaialble in a sport shop. Keep the leaves pressed for at least a fortnight, and between ample newspapers, to prevent moulding. The bands should be tightened at all force, otherwise the leaves may not dry perfectly flattened - drying in an old telephone book definitely is not a good method. Dried leaves can be kept in envelopes. I myself keep them in the same plastic bags that are used for collecting; the bags are arranged as cards in an oldfashioned card file.

collectie - materiaal

minigripzakje

collection specimen

determineren

Mijnen zijn veel variabeler dan insecten, en daarom niet altijd even goed te determineren. Soms is die varabiliteit te begrijpen. Bladeren die in de volle zon groeien zijn dikker dan bladeren van dezelfde plant die permanent in de schaduw liggen. Om de hoeveelheid bladweefsel te eten die voor zijn ontwikkeling nodig is, moet een larve in een dun blad een grotere mijn maken dan wanneer hij in een dik blad zou leven. Mijnen in schaduwbladeren zijn daarom groter, en gangmijnen langer en losser gewonden, dan bij zonbladeren (Bruun, 1989a). Veel banaler is natuurlijk dat mijnen verouderen; door indringend regenwater kan de frass van structuur veranderd zijn of weggevoerd.

Hier komt bij dat van veel soorten de mijnen, maar meer nog de larven onvoldoende beschreven zijn - niet zelden helemaal niet. Bij het maken van de tabellen was dat een groot probleem. Van een gewone soort als bijvoorbeeld Stigmella samiatella is de larve nog steeds niet bekend, en mede daardoor is het onmogelijk om zo veel voorkomende Stigmella-mijnen op eik tot op de soort te determineren (uitgezonderd St. basiguttella).

identifying

Mines are much more variable than insects, and therefore identification is not possible in all cases. Sometimes this variability is understandible. Leaves exposed to the full sun are thicker than leaves of the same plant in permament shadow. To obtain the amount of leaf tissue necessary for complete development, a larva therefore needs to make a mine with a larger in surface when it happens to live in shadow leaf. Blotch mines are larger in this situation, and corridors are longer and more loosely wound (Bruun, 1989a). Much more trivial is the fact that mines grow older; rain water that penetrate the mines may also change the structure of the frass or carry it away.

Another problem is that of many species the mines, but much more still the larvae, are uncompletely known - not infrequently not known at all. This was the main problem in the construction of the keys. For example, the larva of the common Stigmella samiatella is not known. This fact, and the large variability in mine sturcture, make it impossible to identify with certainty the omnipresent and conspicuous Stigmella-mines that occur on Oak (St. basiguttella excepted).

larven en poppen

Larven en poppen kunnen uit de mijn worden gepeuterd met een zeer fijne pincet en prepareerdnaalden. Ze worden voor onderzoek overgebracht in een horlogeglaasje met een paar druppels water en een spoortje detergens (wasmiddel) om te voorkomen dat ze op het opppervlak blijven drijven. Larven worden gedood door ze het horlogeglaasje (eventueel een theelepeltje) kort en snel te verhitten boven een sigarettenaansteker. Verhit de larve niet langer dan totdat de bewegingen geheel gestopt zijn: langer verhitten maakt de larven nodeloos ondoorzichtig, zodat bijvoorbeeld het kopskelet niet meer goed zichtbaar is.

Larven en poppen kunnen worden bewaard in 70% alcohol. Zelf gebruik ik een mengsel dat door E von Törne ontwikkeld is: 1 liter isopropylalcohol + 30 ml ijsazijn (geconcentreerd aziijnzuur) + 3 ml formol 40%.

Als verse larven in een van deze vloeistoffen worden gedompeld wordt snel water aan het lichaam onttrokken, waardoor ze samenklappen, en er onooglijk uit gaan zien. Om dat te voorkomen fixeer ik ze eerst gedurende een paar weken in KAAD: isopropanol 100 ml + ijsazijn 20 ml + kerosine 10 ml + dioxaan 10 ml.

Larven en poppen worden met een nummer-etiket bewaard in kunststof buisjes-met-dekseltje van 1.5 ml, die in biochemische laboratoria als 'epjes' voor eenmalig gebruik gemeengoed zijn. Het nummer correspondeert met eenzelfde nummer in het mijnenherbarium, en een database (Filemaker) waarin alle veldwaarnemingen en determinaties zijn opgeslagen. De buisjes gaan per soort in plastic potjes van 50 cc; ook de etikettering daarvan wordt vanuit de database geprint.

larvae and pupae

Larvae and pupae can be pried out of a mine using a really fine pincet and dissection needles. They are put in a watch glass in a few drops of water with a trace of detergent, to prevent them to float on the water surface. Larvae are killed by briefly and quickly heating the glass (a teaspoon will do too) over a cigarette lighter. Heat them untill all movements have stopped - heating too long will turning the larvae opaque, making observation of internal structures like the cephalic skeleton difficult.

Larvae and pupae can be stored in 70 alcohol (ethanol); I myself use a mixture that has been developed by E von Törne for Collembola: 1 litre of isopropanol + 30 ml concentrated acetic acid + 3 ml formaldehyde 40%.

When fresh larvae are put in either liquid they are quickly dehydrated, and often collapse into something unsightly. To prevent this I fixate them during some weeks in KAAD: isopropanol 100 ml + glacial acetic acid 20 ml + kerosene 10 ml + dioxane 10 ml.

Larvae and pupae are stored with a number-label in plastic tubes of 1.5 ml that are commonly used as disposable 'Eppendorf microvials' in biochemical laboratories. The number corresponds with the number in the mine herbarium and with a databse (Filemaker) in which records are kept of all field data and identifications. The microvials are stored per species in plastic pots of 50 ml; their labelling is also printed from the database.

epjes

epjes

microvials

collectie

potjes

collection

microscopie

Voor het bestudferen van geconserveerde larvenm is het meestal nodig ze op te helderen. Dit kan in chloralphenol, dat is vervloeide phenol ("phenolum liquefactum"), waarin zoveel chloralhydraat is opgelost als mogelijk is. Larven die in deze vloeistof worden gedompeld worden in verloop van enkele minuten glasachtig. Na bestudering kunnen ze weer teruggedaan worden in de conserveervloeistof, en verdwijnt de transparantie. Pas gedode larven barsten als ze in chloralphenol worden gedeponeerd, het is beter ze enige dagen te laten fixeren in de conserveervloeistof. Chloralphenol is giftig, ruikt sterk en niet aangenaam en chloralhydraat is niet vrij verkrijgbaar, daarvoor de is hulp nodig van een bevriend instituut. Ophelderen in kruidnagelolie is eveneens mogelijk, maar ik heb er geen ervaring mee.

Vaste preparaten kunnen worden gemaakt door de larven te behandelen met een verdunde oplossing van KOH, spoelen met gedestilleerd water, overbrengen in alcohol, licht kleuren met Chlorazol Black, en via een alcoholreeks inbedden in Euparal. Een uitvoerige handleiding voor het maken van prepraten van agromyziden-larven staat in Hering (1954a).

microscopy

In order to study larvae that have been preserved it mostly is necessary to clear them. This can be achieved with chloralphenol, which is a saturated solution of chloralhydrate in liquefied phenol. When a small larva is put in a few drops of this liquid is becomes glassy in a few minutes. Freshly killed larvae tend to burst when they are immerseed in chloralphenol, they should be fixated for some days beforehand. Chloralphenol is toxic, and has a strongly unpleasant smell; it is not freely obtainable; in the Netherlands at least one needs the support of an institute to obtain it. For clearing purpose also clove oil has been used, but I have no experience with it.

Permanent slides can be made by treating the larvae with a diluted solution of KOH, rinsing with destilled water, transferring in alcohol, light colouring with Chlorazol Black, and after stepwise hightened alcohol concentration, embedding in Euparal. Hering (1954a) extensively describes the making of slides of Agromyzidae larvae.

foto's

De meeste foto's van mijnen zijn gemaakt met een scanner die de mogelijkheid heeft om ook dia's en grotere foto's te scannen (een 'doorzichtscanner'.) Het merk is Epson Perfection 2450 Photo. De microfoto's worden gemaakt met een Leica stereomiscroscoop (MZ 16) met vast opgebouwde digitale camera (DF 320).

pictures

Most pictures of mines are made with a flatbed scanner that has the additional possibility to make scans of large diapositives and photo negatives (Epson Perfection 2450 Photo). All micro photos are made with a Leica stereo microscope (MZ 16) with a built-in digital camera (DF 320).

literatuur

Deschka (1998a) geeft een uitvoerige bespreking van alle aspecten van de studie van minerende Lepidoptera.

literature

Deschka (1998a) presents an extensive discussion of all aspects of the study of mining Lepidoptera.

01/01/2013